注意：本產(chǎn)品試劑組分和操作步驟發(fā)生變化，使用前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)。 

保存：本產(chǎn)品對(duì)光敏感，應(yīng)該室溫避光儲(chǔ)存，保質(zhì)期 2 年。無(wú)菌開(kāi)封后，保存于室溫。 

試劑盒組成： 

試劑 A 200mL 室溫避光 

試劑 C 100mL 室溫避光 

紅細(xì)胞沉降液 100mL 室溫 

細(xì)胞洗滌液 200mL 室溫 

操作步驟一： 紅細(xì)胞沉降（僅供參考） 

沉降去除紅細(xì)胞：取骨髓單細(xì)胞懸液與血液稀釋液(注射用生理鹽水或 1×PBS)及紅細(xì)胞沉降液按 照 1:1:1 比例混勻，室溫下靜置 30-40min 后，可見(jiàn)紅細(xì)胞沉于試管底部，小心吸取上清層(富含白 細(xì)胞及血小板)用于后續(xù)細(xì)胞分離。 

操作步驟二： 

樣本分離（僅供參考） 

1. 樣本分離：當(dāng)樣本體積小于 5mL 時(shí),先在離心管中先加入 4mL 試劑 A，后將 2mL 試劑 C 小心疊加于試劑 A 之上，形成梯度界面(樣本體 積大于等于 5mL，試劑 A 與試劑 C 比例 2:1，試劑總量等于沉降后樣 本含量),將懸液小心平鋪于分離液液面上方。由于密度差異，可見(jiàn)明 顯的分層界面(注意二者的總體積不能超過(guò)離心管的三分之二，否則會(huì) 影響分離效果)。 

2. 室溫條件下水平轉(zhuǎn)子 600-1000g ，25-30min(血液體積越大所需離 心力越大,離心時(shí)間越長(zhǎng),最佳分離條件需摸索，離心最大轉(zhuǎn)速不超過(guò) 1000g)。

3. 離心后，離心管中可見(jiàn)兩個(gè)環(huán)狀乳白色層，上層為單個(gè)核細(xì)胞層,下層即所需中性粒細(xì)胞層(受 個(gè)體差異及分離條件影響，粒細(xì)胞白膜層可能會(huì)出現(xiàn)顏色較淺的情況)。 

4. 用吸管吸取下層中性粒細(xì)胞白膜層至新的離心管中，加入 10mL 細(xì)胞清洗液洗滌細(xì)胞，250g，離 心 10min。 

5. 棄上清,加入 5mL 細(xì)胞清洗液重懸細(xì)胞,250g，離心 5min。 

6. 棄上清，重懸細(xì)胞備用。 

骨髓單細(xì)胞懸液制備： 

小動(dòng)物骨髓的采集： 

1. 處死動(dòng)物，無(wú)菌提取股骨和脛骨，剪去兩端軟骨，露出紅色的骨髓腔（注意盡可能少的剪走骨 髓腔）。 

2. 取 1ml 的無(wú)菌注射器，吸取少量的含有 10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的稀釋液或者是含有血清的培養(yǎng)基，沖 洗骨髓腔以獲得骨髓。 

3. 最終制備成 2×10 8–1×10 9 /ml 的單細(xì)胞懸液備用。 

大動(dòng)物骨髓的采集： 

大動(dòng)物骨髓的采集可采取活體穿刺方法：先將動(dòng)物麻醉、固定、局部除毛、消毒皮膚，然后估計(jì)好 皮膚到骨髓的距離，把骨髓穿刺針的長(zhǎng)度固定好。操作人員用左手把穿刺點(diǎn)周?chē)钠つw繃緊，右手 將穿刺針在穿刺點(diǎn)垂直刺入，輕輕左右旋轉(zhuǎn)將穿刺針鉆入，當(dāng)穿刺針進(jìn)入骨髓腔時(shí)常有落空感。連 接注射器緩慢抽吸骨髓組織，當(dāng)注射器內(nèi)抽到少許骨髓時(shí)即停止抽吸。用含 10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的稀 釋液調(diào)整細(xì)胞濃度為 2×10 8–1×10 9 /ml 的單細(xì)胞懸液備用。 

常用的骨髓穿刺點(diǎn)： 

股骨：穿刺部位在股骨內(nèi)側(cè)面,靠下端的凹面處； 

胸骨：穿刺部位是胸骨體與胸骨柄連接處； 

肋骨：穿刺部位是第 5～7 肋骨各點(diǎn)的中點(diǎn)； 

脛骨：穿刺部位是股骨內(nèi)側(cè)、靠下端的凹面處。

如果穿刺采用的是肋骨，穿刺結(jié)束后要用膠布封貼 穿刺孔，防止發(fā)生氣胸。 

注意事項(xiàng)： 

A.開(kāi)封前顛倒混勻，本分離液為無(wú)菌產(chǎn)品，為延長(zhǎng)分離液保存時(shí)間，請(qǐng)?jiān)跓o(wú)菌條件下啟封，避免 微生物污染。 

B.分離液使用時(shí)應(yīng)始終保持室溫（18℃~25℃），如室內(nèi)溫度較低，可將分離液預(yù)熱。4℃或者是 溫度較低的條件下離心，可能會(huì)導(dǎo)致白膜層不清晰。 

C.血液樣本最好為新鮮抗凝血（采血 2h 以?xún)?nèi)），為保持中性粒細(xì)胞的活性，應(yīng)避免冷凍和冷藏。 

D.稀釋血液或洗滌細(xì)胞，不可使用含 Ca、Mg 離子的緩沖液及培養(yǎng)液，其成分會(huì)導(dǎo)致血細(xì)胞凝集， 大大降低細(xì)胞得率及純度。

E.部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其帶有的靜電作用，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞掛壁，影響分離效果。 

F.血液樣本的粘稠度或者是溫度差異，可能會(huì)影響分離效果，可以調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù)和離心時(shí)間，摸索 最佳的分離條件。 

G.如果要進(jìn)一步對(duì)分離的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，注意全程保持無(wú)菌操作，避免微生物污染。 

H.不同動(dòng)物血液在不同比重分離液中的細(xì)胞離散系數(shù)及細(xì)胞帶電不同，用戶(hù)在制定分離液時(shí)應(yīng)提 供所需分離液的比重、動(dòng)物種屬及被分離細(xì)胞的名稱(chēng)。

牛骨髓中性粒細(xì)胞分離液試劑盒

牛骨髓中性粒細(xì)胞分離液試劑盒