遺傳霉素又稱(chēng)新霉素(geneticin, G418)，是一種氨基糖苷類(lèi)抗生素，是細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染常用的抗性篩選試劑。
產(chǎn)品篩選
由于每種細(xì)胞對(duì)G418的敏感性不同，而且不同的廠家生產(chǎn)的相同濃度的G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定G418的佳篩選濃度。具體如下：將細(xì)胞稀釋到1000個(gè)細(xì)胞/mL，在100ug/mL~1mg/mL的G418濃度范圍內(nèi)進(jìn)行篩選，選擇出在10~14天內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的低G418濃度來(lái)進(jìn)行下一步的篩選試驗(yàn)。
由于每種細(xì)胞對(duì)G418的敏感性不同，一般變動(dòng)在100ug/ml～1000ug/ml范圍。在篩選之前，一定要確定細(xì)胞對(duì)這一批G418的佳篩選濃度。盡管如此，特性明確的細(xì)胞系G418的佳用量還是穩(wěn)定的?！斗肿涌寺 方o出了幾個(gè)常用細(xì)胞系所需G418的佳用量。
由于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)之后要一段時(shí)間才能表達(dá)出蛋白質(zhì)。所以篩選不能太早；但是也不能太晚，因?yàn)檗D(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大，增值較慢，時(shí)間長(zhǎng)了就會(huì)被沒(méi)有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒(méi)，終導(dǎo)致篩選不出陽(yáng)性克隆，一般要在轉(zhuǎn)染24小時(shí)之后才開(kāi)始加G418篩選。隨著細(xì)胞的代謝G418的濃度和活性都會(huì)下降，所以每3~5天都要更換一次含有G418的篩選液。這時(shí)藥物濃度可以降200ug/ml。
加藥篩選約6天左右，細(xì)胞會(huì)大量死亡，孔中只剩下的細(xì)胞。這時(shí)會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)問(wèn)題：1.死亡的細(xì)胞會(huì)裂解釋放出有害物質(zhì)，導(dǎo)致那些有neo表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞死亡，即非選擇性死亡。2.孔中細(xì)胞數(shù)目很少，細(xì)胞之間的信號(hào)會(huì)變得很弱，也會(huì)導(dǎo)致陽(yáng)性細(xì)胞的狀態(tài)不佳甚死亡。這個(gè)時(shí)候需要一種特殊的培養(yǎng)液：假如你要轉(zhuǎn)染3T3細(xì)胞，在3T3細(xì)胞匯合度達(dá)到80%的時(shí)候，換液，培養(yǎng)過(guò)夜之后收集培養(yǎng)液，通過(guò)濾器消毒，和新鮮的培養(yǎng)液按1：1混合備用。再轉(zhuǎn)染后篩選過(guò)程中就可以應(yīng)用這種培養(yǎng)基。
為了盡量減少陰性克隆的死亡給陽(yáng)性克隆造成的不利影響以及增加陽(yáng)性克隆的得率，可以應(yīng)用套環(huán)法或刮除法結(jié)合有限稀釋法來(lái)篩選陽(yáng)性克隆。加藥后，在高倍鏡下，陽(yáng)性克隆和陰性克隆很容易辨認(rèn)，在陽(yáng)性克隆下用記號(hào)筆做個(gè)標(biāo)記。然后刮除陰性克隆，消化陽(yáng)性克隆后繼續(xù)篩選培養(yǎng)；或者用套環(huán)套住陽(yáng)性克隆，在套環(huán)內(nèi)加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一個(gè)新的孔中培養(yǎng)。后再用有限稀釋法把陽(yáng)性克隆在96孔板中篩選。
一般經(jīng)過(guò)4周左右的篩選，得到的陽(yáng)性克隆都比較穩(wěn)定。但是外源基因如果沒(méi)有整合到基因組中的話，目的基因還是很容易丟失的。但是外源基因整合到基因組中的概率太小了，而且是隨機(jī)整合，會(huì)導(dǎo)致表達(dá)的目的蛋白的量產(chǎn)生很大差異。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù)，那些丟失了外源基因的細(xì)胞和很少表達(dá)目的基因的細(xì)胞會(huì)占據(jù)優(yōu)勢(shì)，強(qiáng)表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞會(huì)越來(lái)越少。這樣再次篩選是*的。只有經(jīng)過(guò)2次以上的篩選之后才能找到那種我們想要的強(qiáng)分泌目的蛋白的，遺傳穩(wěn)定的細(xì)胞克隆。
