線粒體膜電位檢測試劑盒的操作規(guī)程和注意事項
1、JC-1染色工作液的配制：
a、取100μL 10×染色結合液加900μL滅菌雙蒸水稀釋成1× 染色結合液，混勻并預熱37℃；
b、吸取500μL 1×染色結合液，加入1μL JC-1，劇烈Vortex充分溶解，混勻配成JC-1工作液；
c、因JC-1在水中的溶解度很小，所以可以通過離心的方法（10，000rpm，1min）去除不溶的顆粒，吸取離心后的上清使用，以消除干擾。離心后的上清為JC-1工作液
2、用適當的方法誘導細胞凋亡，同時設立陰性對照組和陽性對照組【用適當的凋亡誘導劑，誘導適當時間后經其它檢測（如AnnexinV或 Caspase 3活性）證實確有凋亡產生】，收集細胞；
3、用PBS洗滌細胞二次（離心2000rpm，5min），收集不多于1×106的細胞；
4、取500μL JC-1工作液將細胞均勻懸浮，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育15~20min；
5、室溫離心（2000rpm，5min）收集細胞，用500μL 1×染色結合液洗滌兩次；
6、吸取500μL 1× Incubation Buffer重新懸浮細胞；
7、熒光顯微鏡觀察或流式細胞儀分析。
A、熒光顯微鏡觀察
1.滴一滴上述細胞懸液于載玻片，蓋上蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察；
2.對于貼壁細胞來說，也可直接用蓋玻片來培養(yǎng)細胞并誘導細胞凋亡；用PBS洗滌細胞兩次；
滴加100μL JC-1工作液，加蓋玻片，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育15~20min；1×染色結合液洗滌1~2遍；將蓋玻片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡下觀察；
1、JC-1在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內，可以20-25℃水浴溫育片刻全部融解后使用。
2、對PH變化過于敏感的細胞建議用胎牛血清取代Buffer孵育染色及洗滌，或延長觀測時間。
3、流式細胞儀檢測線粒體膜電位變化受到多種因素的影響，因誘導劑、細胞株類型，作用時間的不同而熒光強度比例都有不同，因此沒有通用標準的補償設門指南，因此每個試驗需設陰性及陽性對照組進行熒光補償及設門。
4、加入JC-1并洗滌后盡量在30分鐘內完成后續(xù)檢測。
5、組織需先制備單細胞懸液或提取純化線粒體后方可進行檢測。
6、如果發(fā)現(xiàn)染色結合緩沖液中有沉淀，必須全部溶解后才能使用。
7、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
