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線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒的操作規(guī)程和注意事項(xiàng)
線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒的操作規(guī)程和注意事項(xiàng)
  線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒操作規(guī)程
  1、JC-1染色工作液的配制:
  a、取100μL 10×染色結(jié)合液加900μL滅菌雙蒸水稀釋成1× 染色結(jié)合液,混勻并預(yù)熱37℃;
  b、吸取500μL  1×染色結(jié)合液,加入1μL JC-1,劇烈Vortex充分溶解,混勻配成JC-1工作液;
  c、因JC-1在水中的溶解度很小,所以可以通過(guò)離心的方法(10,000rpm,1min)去除不溶的顆粒,吸取離心后的上清使用,以消除干擾。離心后的上清為JC-1工作液
  2、用適當(dāng)?shù)姆椒ㄕT導(dǎo)細(xì)胞凋亡,同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組【用適當(dāng)?shù)牡蛲稣T導(dǎo)劑,誘導(dǎo)適當(dāng)時(shí)間后經(jīng)其它檢測(cè)(如AnnexinV或 Caspase 3活性)證實(shí)確有凋亡產(chǎn)生】,收集細(xì)胞;
  3、用PBS洗滌細(xì)胞二次(離心2000rpm,5min),收集不多于1×106的細(xì)胞;
  4、取500μL JC-1工作液將細(xì)胞均勻懸浮,37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育15~20min;
  5、室溫離心(2000rpm,5min)收集細(xì)胞,用500μL 1×染色結(jié)合液洗滌兩次;
  6、吸取500μL  1× Incubation Buffer重新懸浮細(xì)胞;
  7、熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀分析。
  A、熒光顯微鏡觀察
  1.滴一滴上述細(xì)胞懸液于載玻片,蓋上蓋玻片,于熒光顯微鏡下觀察;
  2.對(duì)于貼壁細(xì)胞來(lái)說(shuō),也可直接用蓋玻片來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;用PBS洗滌細(xì)胞兩次;
  滴加100μL JC-1工作液,加蓋玻片,37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育15~20min;1×染色結(jié)合液洗滌1~2遍;將蓋玻片倒置于載玻片上,于熒光顯微鏡下觀察;
  線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒注意事項(xiàng):
  1、JC-1在4℃、冰浴等較低溫度情況下會(huì)凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi),可以20-25℃水浴溫育片刻全部融解后使用。
  2、對(duì)PH變化過(guò)于敏感的細(xì)胞建議用胎牛血清取代Buffer孵育染色及洗滌,或延長(zhǎng)觀測(cè)時(shí)間。
  3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位變化受到多種因素的影響,因誘導(dǎo)劑、細(xì)胞株類型,作用時(shí)間的不同而熒光強(qiáng)度比例都有不同,因此沒(méi)有通用標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)償設(shè)門(mén)指南,因此每個(gè)試驗(yàn)需設(shè)陰性及陽(yáng)性對(duì)照組進(jìn)行熒光補(bǔ)償及設(shè)門(mén)。
  4、加入JC-1并洗滌后盡量在30分鐘內(nèi)完成后續(xù)檢測(cè)。
  5、組織需先制備單細(xì)胞懸液或提取純化線粒體后方可進(jìn)行檢測(cè)。
  6、如果發(fā)現(xiàn)染色結(jié)合緩沖液中有沉淀,必須全部溶解后才能使用。
  7、為了您的安全和健康,請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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