線粒體膜電位檢測試劑盒的操作規(guī)程和注意事項(xiàng)
1、JC-1染色工作液的配制：
a、取100μL 10×染色結(jié)合液加900μL滅菌雙蒸水稀釋成1× 染色結(jié)合液，混勻并預(yù)熱37℃；
b、吸取500μL 1×染色結(jié)合液，加入1μL JC-1，劇烈Vortex充分溶解，混勻配成JC-1工作液；
c、因JC-1在水中的溶解度很小，所以可以通過離心的方法（10，000rpm，1min）去除不溶的顆粒，吸取離心后的上清使用，以消除干擾。離心后的上清為JC-1工作液
2、用適當(dāng)?shù)姆椒ㄕT導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組【用適當(dāng)?shù)牡蛲稣T導(dǎo)劑，誘導(dǎo)適當(dāng)時(shí)間后經(jīng)其它檢測（如AnnexinV或 Caspase 3活性）證實(shí)確有凋亡產(chǎn)生】，收集細(xì)胞；
3、用PBS洗滌細(xì)胞二次（離心2000rpm，5min），收集不多于1×106的細(xì)胞；
4、取500μL JC-1工作液將細(xì)胞均勻懸浮，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育15~20min；
5、室溫離心（2000rpm，5min）收集細(xì)胞，用500μL 1×染色結(jié)合液洗滌兩次；
6、吸取500μL 1× Incubation Buffer重新懸浮細(xì)胞；
7、熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀分析。
A、熒光顯微鏡觀察
1.滴一滴上述細(xì)胞懸液于載玻片，蓋上蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察；
2.對(duì)于貼壁細(xì)胞來說，也可直接用蓋玻片來培養(yǎng)細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；用PBS洗滌細(xì)胞兩次；
滴加100μL JC-1工作液，加蓋玻片，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育15~20min；1×染色結(jié)合液洗滌1~2遍；將蓋玻片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡下觀察；
1、JC-1在4℃、冰浴等較低溫度情況下會(huì)凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以20-25℃水浴溫育片刻全部融解后使用。
2、對(duì)PH變化過于敏感的細(xì)胞建議用胎牛血清取代Buffer孵育染色及洗滌，或延長觀測時(shí)間。
3、流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位變化受到多種因素的影響，因誘導(dǎo)劑、細(xì)胞株類型，作用時(shí)間的不同而熒光強(qiáng)度比例都有不同，因此沒有通用標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)償設(shè)門指南，因此每個(gè)試驗(yàn)需設(shè)陰性及陽性對(duì)照組進(jìn)行熒光補(bǔ)償及設(shè)門。
4、加入JC-1并洗滌后盡量在30分鐘內(nèi)完成后續(xù)檢測。
5、組織需先制備單細(xì)胞懸液或提取純化線粒體后方可進(jìn)行檢測。
6、如果發(fā)現(xiàn)染色結(jié)合緩沖液中有沉淀，必須全部溶解后才能使用。
7、為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
