操作步驟
1
準(zhǔn)備好所有需要的試劑及工作濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。
2
分別設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)孔、0孔和樣本孔，計(jì)算好當(dāng)次試驗(yàn)所需要的板條數(shù)量，將不需要的板條拆卸下來，用新的封板膜重新封好，放回裝有干燥劑的鋁箔袋。
3
加標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品孔加入50 μL的2倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品。0孔加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液。
4
加樣本：樣本孔加入50 μL的待測樣本。
5
加生物素化檢測抗體：立即每孔加入50 μL生物素化抗體工作液至反應(yīng)孔中。保證步驟3、4、5連續(xù)加樣，不要間斷。加樣過程在10 min內(nèi)完成。
6
孵育：使用新的封板膜封板。37℃靜置孵育45 min。
7
洗滌：棄掉液體，每孔加入300 μL洗液洗板，洗滌3次。每次洗板，在吸水紙上拍干。
提示：為獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，必須移除干凈殘留液體。洗板完成之后，請(qǐng)立即進(jìn)行下步操作，不要讓微孔板干燥。
8
加酶結(jié)合物：加入100 μL酶結(jié)合物工作液至反應(yīng)孔中。
9
孵育：使用新的封板膜封板。封板后于37℃靜置孵育30 min。
10
洗滌：棄掉液體，每孔加入300 μL洗液洗板，洗滌5次。每次洗板，在吸水紙上拍干。為獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，必須移除干凈殘留液體。
提示：為獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，必須移除干凈殘留液體。洗板完成之后，請(qǐng)立即進(jìn)行下步操作，不要讓微孔板干燥。
11
加底物顯色：每孔加入90 μL顯色底物TMB，避光，37℃避光顯色15 min。
提示：可根據(jù)實(shí)際顯色情況酌情縮短或延長顯色時(shí)間，但不可超過30 min。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔顏色出現(xiàn)明顯梯度時(shí)，即可終止。提前15 min打開酶標(biāo)儀預(yù)熱。
12
加終止液：每孔加入50 μL終止液，終止液加入的順序應(yīng)盡量與顯色底物加入的順序相同。
提示：終止液加入后微孔板內(nèi)液體的顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。如果顏色呈現(xiàn)綠色或者顏色的變化明顯不均勻，請(qǐng)輕輕叩擊板框，水平充分混勻。
13
檢測讀數(shù)：在5 min之內(nèi)，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行雙波長檢測，測定450 nm最大吸收波長和630 nm參考波長下的OD值。
提示：校準(zhǔn)后的OD值為450 nm的測定值減去630 nm的測定值。（注：630 nm OD值為酶標(biāo)板材質(zhì)吸收值。若不能進(jìn)行雙波長檢測，可只測定450 nm波長下的OD值，但數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度會(huì)降低一些）
注意事項(xiàng)
檢測之前請(qǐng)將所有的試劑、樣本平衡至室溫。
樣本復(fù)融后若有沉淀，需再次離心，取上清檢測。
試劑或樣本配制時(shí)，需充分混勻并盡量避免起泡。
標(biāo)曲和樣本建議做復(fù)孔檢測。
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