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夾心法ELISA操作步驟


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操作步驟


1

分別設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)孔、0孔和樣本孔,計算好當(dāng)次試驗(yàn)所需要的板條數(shù)量,將不需要的板條拆卸下來,用新的封板膜重新封好,放回裝有干燥劑的鋁箔袋。

2

浸泡酶標(biāo)板:加入300 μL 1×洗滌液靜置浸泡30秒,棄掉洗滌液之后,在吸水紙上將微孔板拍干,重復(fù)2次。

提示:洗板完成之后,請立即使用微孔板,不要讓微孔板干燥。

3

加標(biāo)準(zhǔn)品:標(biāo)準(zhǔn)品孔加入100 μL的2倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品。0孔加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液。

4

加樣本:樣本孔加入100 μL的待測樣本。保證連續(xù)加樣,不要間斷。加樣過程在10 min內(nèi)完成。

5

孵育:使用新的封板膜封板。37℃靜置孵育90 min。

6

洗滌:棄掉液體,每孔加入300 μL洗液洗板,洗滌4次。每次洗板,在吸水紙上拍干。

提示:為獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,必須干凈移除殘留液體。洗板完成之后,請立即進(jìn)行下步操作,不要讓微孔板干燥。

7

加生物素化檢測抗體:加入100 μL生物素化抗體工作液至反應(yīng)孔中。

8

孵育:使用新的封板膜封板。37℃靜置孵育60 min。

9

洗滌:棄掉液體,每孔加入300 μL洗液洗板,洗滌4次。每次洗板,在吸水紙上拍干。

提示:為獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,必須干凈移除殘留液體。洗板完成之后,請立即進(jìn)行下步操作,不要讓微孔板干燥。

10

加酶結(jié)合物:加入100 μL酶結(jié)合物工作液至反應(yīng)孔中。

11

孵育:使用新的封板膜封板。封板后于37℃靜置孵育30 min。

12

洗滌:棄掉液體,每孔加入300 μL洗液洗板,洗滌5次。每次洗板,在吸水紙上拍干。

提示:為獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,必須干凈移除殘留液體。洗板完成之后,請立即進(jìn)行下步操作,不要讓微孔板干燥。

13

加底物顯色:每孔加入100 μL顯色底物TMB,避光,37℃避光顯色15 min。

提示:可根據(jù)實(shí)際顯色情況酌情縮短或延長顯色時間,但不可超過30 min。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔顏色出現(xiàn)明顯梯度時(標(biāo)準(zhǔn)孔的前4孔出現(xiàn)明顯的藍(lán)色梯度,后3~4孔不明顯),即可終止。提前15 min打開酶標(biāo)儀預(yù)熱。

14

加終止液:每孔加入50 μL終止液,終止液加入的順序應(yīng)盡量與顯色底物加入的順序相同。

提示:終止液加入后微孔板內(nèi)液體的顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。如果顏色呈現(xiàn)綠色或者顏色的變化明顯不均勻,請輕輕叩擊板框,水平充分混勻。

15

檢測讀數(shù):在5 min之內(nèi),使用酶標(biāo)儀進(jìn)行雙波長檢測,測定450 nm最大吸收波長和630 nm參考波長下的OD值。

提示:校準(zhǔn)后的OD值為450 nm的測定值減去630 nm的測定值。(注:630 nm OD值為酶標(biāo)板材質(zhì)吸收值。若不能進(jìn)行雙波長檢測,可只測定450 nm波長下的OD值,但數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度會降低一些)


注意事項:

檢測之前請將所有的試劑、樣本平衡至室溫。

樣本復(fù)融后若有沉淀,需再次離心,取上清檢測。

試劑或樣本配制時,需充分混勻并盡量避免起泡。

標(biāo)曲和樣本建議做復(fù)孔檢測。

檢測實(shí)驗(yàn)操作前,準(zhǔn)備好所有需要的試劑及工作濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。



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