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細(xì)胞免疫療法已在腫瘤治療中取得重要的突破性成果，是最有希望消除腫瘤的治療方法之一。但該方法在實際臨床應(yīng)用中仍存在著困難與挑戰(zhàn)。最大的局限性是靶材料胞內(nèi)遞送的有效性，這是很多基因編輯免疫療法中的關(guān)鍵步驟。因此需要開發(fā)高效、低細(xì)胞損傷且具有高通量的胞內(nèi)遞送方法，來實現(xiàn)大規(guī)模臨床應(yīng)用。脂質(zhì)體或聚合物誘導(dǎo)的內(nèi)吞方法對大多數(shù)細(xì)胞具有價值，但是不適合免疫細(xì)胞，因為免疫細(xì)胞能夠?qū)⑦@類遞送載體識別為外來敵對物并將其清除。與由質(zhì)粒DNA或mRNA間接表達(dá)的載體傳遞系統(tǒng)（即脂質(zhì)體、聚合物、慢病毒等）相比，更理想的方法是直接遞送蛋白質(zhì)，它可以消除質(zhì)粒表達(dá)的過程，減少培養(yǎng)時間，從而提高轉(zhuǎn)染效率，降低風(fēng)險。

近年來，基于瞬時膜變形破壞的胞內(nèi)傳遞技術(shù)備受重視，其幾乎可以遞送任何亞微米級靶材料，廣泛適用于各種細(xì)胞。例如電穿孔技術(shù)，能夠通過在特定電壓和頻率下一系列的電脈沖來控制細(xì)胞膜的瞬時膜變形破壞（即膜的快速打開和關(guān)閉）使靶物質(zhì)能夠瞬間遞送到細(xì)胞內(nèi)，為免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染提供了機會。但這類方法缺乏對膜穿孔變形的精確控制，過度的電場會對細(xì)胞行為產(chǎn)生不可預(yù)測的影響外，還可能導(dǎo)致細(xì)胞成分損傷（如蛋白質(zhì)變性等）。相比之下，微流控和納米技術(shù)可以精確地控制膜擾動，從而實現(xiàn)瞬時膜穿孔和隨后的胞內(nèi)遞送，在解決胞內(nèi)遞送問題中具有潛力。微流控和納米結(jié)構(gòu)可以適用于多種不同哺乳動物細(xì)胞體積和不同尺寸的細(xì)胞膜實現(xiàn)膜穿孔。細(xì)胞膜的機械擾動可通過微流體剪切、尖銳微納米結(jié)構(gòu)的擠壓和其他手段來實現(xiàn)，納米技術(shù)與激光或電的結(jié)合已經(jīng)證明了膜穿孔的可行性。這種方法可獲得很好的胞內(nèi)遞送效果，遞送效率約80%。納米針可在細(xì)胞表面相當(dāng)小的區(qū)域內(nèi)集中作用力，實現(xiàn)精確的膜穿孔和靶物質(zhì)的胞內(nèi)遞送，在解決細(xì)胞內(nèi)傳遞效率和細(xì)胞活力方面具有巨大潛力。但其應(yīng)用于懸浮細(xì)胞例如NK細(xì)胞、T細(xì)胞等時仍然存在困難，這類細(xì)胞不能自發(fā)的接觸納米針，需要在微流控和表面區(qū)域共同作用下進行精確捕獲和控制，因此阻礙了納米針在免疫細(xì)胞的胞內(nèi)遞送和隨后的免疫治療中的應(yīng)用。目前的微納米結(jié)構(gòu)胞內(nèi)傳遞技術(shù)受到低通量或小劑量的限制，微納米結(jié)構(gòu)的小組裝面積是影響其進一步發(fā)展到高通量的關(guān)鍵問題。因此，目前仍需開發(fā)針對懸浮免疫細(xì)胞的膜穿孔系統(tǒng)，實現(xiàn)高效、低損傷、高通量的胞內(nèi)遞送方法，進而提高其真正的臨床應(yīng)用潛力。

由硅納米針陣列基底和PDMS微通道組成的細(xì)胞內(nèi)遞送芯片的示意圖（圖1a、1b）。散射區(qū)由微米柱陣列組成，可使細(xì)胞充分分散防止它們粘成團塊（圖1c）。平行微通道的高度略高于細(xì)胞直徑，可使細(xì)胞分別穿過穿孔區(qū)域，避免細(xì)胞堆積和阻塞，提高細(xì)胞內(nèi)遞送的陽性率和通量（圖1d）。不同流道中的流場條件保持高度一致（圖1e）。在穿刺區(qū)平行通道的下方覆蓋了大面積硅納米針陣列，通過機械穿刺實現(xiàn)精確的膜穿孔（圖1f）。機械振動驅(qū)使細(xì)胞在微通道中相對運動，使細(xì)胞能夠快速與納米針碰撞和脫離，從而實現(xiàn)細(xì)胞膜的快速穿孔（圖1g）。納米針的膜穿孔大小可以充分滿足要求，可使大分子、蛋白質(zhì)等物質(zhì)從周圍介質(zhì)擴散到細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)中（圖1g）。典型“站立姿勢"細(xì)胞被刺穿并連接到納米針基底上（圖1h）。圖1i是凍干后納米針穿刺殘留細(xì)胞膜的掃描電鏡圖，可直觀地顯示膜穿孔。

近年來細(xì)胞免疫不斷發(fā)展，基因修飾NK細(xì)胞的免疫治療機制日益明確，瓶頸問題是如何有效實現(xiàn)靶材料的胞內(nèi)遞送和基因編輯。高效、標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞內(nèi)傳遞技術(shù)是其進一步發(fā)展的關(guān)鍵?；谖⒓{米粒子自組裝模板的制備技術(shù)是形成大面積微納米陣列結(jié)構(gòu)的重要手段之一。作者將大面積納米針與微流控技術(shù)相結(jié)合形成振動輔助納米針/微流控復(fù)合系統(tǒng)，納米針的尺寸與靶Cas9蛋白相匹配且通過機械膜穿孔成功實現(xiàn)了高通量、高效和低損傷的NK-92胞內(nèi)遞送和遺傳修飾。CD96敲除NK-92細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，抑制CD96可顯著提高NK-92細(xì)胞的免疫功能，表明該系統(tǒng)進一步在免疫治療臨床應(yīng)用中的巨大潛力。

與目前的CAR-T免疫治療方法相比，NK細(xì)胞相關(guān)的免疫治療具有更好的安全性、多種激活細(xì)胞毒活性的機制等優(yōu)點。一旦安全性和制備方面的問題得到解決，其有望在癌癥治療中帶來更好的效果，NK-92細(xì)胞基因編輯結(jié)果表明該系統(tǒng)能實現(xiàn)這一功能。未來工作中將構(gòu)建原型，以達(dá)到真正臨床應(yīng)用的目的。