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細胞免疫療法已在腫瘤治療中取得重要的突破性成果，是最有希望消除腫瘤的治療方法之一。但該方法在實際臨床應(yīng)用中仍存在著困難與挑戰(zhàn)。最大的局限性是靶材料胞內(nèi)遞送的有效性，這是很多基因編輯免疫療法中的關(guān)鍵步驟。因此需要開發(fā)高效、低細胞損傷且具有高通量的胞內(nèi)遞送方法，來實現(xiàn)大規(guī)模臨床應(yīng)用。脂質(zhì)體或聚合物誘導(dǎo)的內(nèi)吞方法對大多數(shù)細胞具有價值，但是不適合免疫細胞，因為免疫細胞能夠?qū)⑦@類遞送載體識別為外來敵對物并將其清除。與由質(zhì)粒DNA或mRNA間接表達的載體傳遞系統(tǒng)（即脂質(zhì)體、聚合物、慢病毒等）相比，更理想的方法是直接遞送蛋白質(zhì)，它可以消除質(zhì)粒表達的過程，減少培養(yǎng)時間，從而提高轉(zhuǎn)染效率，降低風(fēng)險。

近年來，基于瞬時膜變形破壞的胞內(nèi)傳遞技術(shù)備受重視，其幾乎可以遞送任何亞微米級靶材料，廣泛適用于各種細胞。例如電穿孔技術(shù)，能夠通過在特定電壓和頻率下一系列的電脈沖來控制細胞膜的瞬時膜變形破壞（即膜的快速打開和關(guān)閉）使靶物質(zhì)能夠瞬間遞送到細胞內(nèi)，為免疫細胞轉(zhuǎn)染提供了機會。但這類方法缺乏對膜穿孔變形的精確控制，過度的電場會對細胞行為產(chǎn)生不可預(yù)測的影響外，還可能導(dǎo)致細胞成分損傷（如蛋白質(zhì)變性等）。相比之下，微流控和納米技術(shù)可以精確地控制膜擾動，從而實現(xiàn)瞬時膜穿孔和隨后的胞內(nèi)遞送，在解決胞內(nèi)遞送問題中具有潛力。微流控和納米結(jié)構(gòu)可以適用于多種不同哺乳動物細胞體積和不同尺寸的細胞膜實現(xiàn)膜穿孔。細胞膜的機械擾動可通過微流體剪切、尖銳微納米結(jié)構(gòu)的擠壓和其他手段來實現(xiàn)，納米技術(shù)與激光或電的結(jié)合已經(jīng)證明了膜穿孔的可行性。這種方法可獲得很好的胞內(nèi)遞送效果，遞送效率約80%。納米針可在細胞表面相當(dāng)小的區(qū)域內(nèi)集中作用力，實現(xiàn)精確的膜穿孔和靶物質(zhì)的胞內(nèi)遞送，在解決細胞內(nèi)傳遞效率和細胞活力方面具有巨大潛力。但其應(yīng)用于懸浮細胞例如NK細胞、T細胞等時仍然存在困難，這類細胞不能自發(fā)的接觸納米針，需要在微流控和表面區(qū)域共同作用下進行精確捕獲和控制，因此阻礙了納米針在免疫細胞的胞內(nèi)遞送和隨后的免疫治療中的應(yīng)用。目前的微納米結(jié)構(gòu)胞內(nèi)傳遞技術(shù)受到低通量或小劑量的限制，微納米結(jié)構(gòu)的小組裝面積是影響其進一步發(fā)展到高通量的關(guān)鍵問題。因此，目前仍需開發(fā)針對懸浮免疫細胞的膜穿孔系統(tǒng)，實現(xiàn)高效、低損傷、高通量的胞內(nèi)遞送方法，進而提高其真正的臨床應(yīng)用潛力。

由硅納米針陣列基底和PDMS微通道組成的細胞內(nèi)遞送芯片的示意圖（圖1a、1b）。散射區(qū)由微米柱陣列組成，可使細胞充分分散防止它們粘成團塊（圖1c）。平行微通道的高度略高于細胞直徑，可使細胞分別穿過穿孔區(qū)域，避免細胞堆積和阻塞，提高細胞內(nèi)遞送的陽性率和通量（圖1d）。不同流道中的流場條件保持高度一致（圖1e）。在穿刺區(qū)平行通道的下方覆蓋了大面積硅納米針陣列，通過機械穿刺實現(xiàn)精確的膜穿孔（圖1f）。機械振動驅(qū)使細胞在微通道中相對運動，使細胞能夠快速與納米針碰撞和脫離，從而實現(xiàn)細胞膜的快速穿孔（圖1g）。納米針的膜穿孔大小可以充分滿足要求，可使大分子、蛋白質(zhì)等物質(zhì)從周圍介質(zhì)擴散到細胞內(nèi)基質(zhì)中（圖1g）。典型“站立姿勢"細胞被刺穿并連接到納米針基底上（圖1h）。圖1i是凍干后納米針穿刺殘留細胞膜的掃描電鏡圖，可直觀地顯示膜穿孔。

近年來細胞免疫不斷發(fā)展，基因修飾NK細胞的免疫治療機制日益明確，瓶頸問題是如何有效實現(xiàn)靶材料的胞內(nèi)遞送和基因編輯。高效、標準的細胞內(nèi)傳遞技術(shù)是其進一步發(fā)展的關(guān)鍵?；谖⒓{米粒子自組裝模板的制備技術(shù)是形成大面積微納米陣列結(jié)構(gòu)的重要手段之一。作者將大面積納米針與微流控技術(shù)相結(jié)合形成振動輔助納米針/微流控復(fù)合系統(tǒng)，納米針的尺寸與靶Cas9蛋白相匹配且通過機械膜穿孔成功實現(xiàn)了高通量、高效和低損傷的NK-92胞內(nèi)遞送和遺傳修飾。CD96敲除NK-92細胞中發(fā)現(xiàn)，抑制CD96可顯著提高NK-92細胞的免疫功能，表明該系統(tǒng)進一步在免疫治療臨床應(yīng)用中的巨大潛力。

與目前的CAR-T免疫治療方法相比，NK細胞相關(guān)的免疫治療具有更好的安全性、多種激活細胞毒活性的機制等優(yōu)點。一旦安全性和制備方面的問題得到解決，其有望在癌癥治療中帶來更好的效果，NK-92細胞基因編輯結(jié)果表明該系統(tǒng)能實現(xiàn)這一功能。未來工作中將構(gòu)建原型，以達到真正臨床應(yīng)用的目的。