文獻(xiàn)背景
細(xì)胞免疫療法已在腫瘤治療中取得重要的突破性成果，是最有希望消除腫瘤的治療方法之一。但該方法在實(shí)際臨床應(yīng)用中仍存在著困難與挑戰(zhàn)。最大的局限性是靶材料胞內(nèi)遞送的有效性，這是很多基因編輯免疫療法中的關(guān)鍵步驟。因此需要開發(fā)高效、低細(xì)胞損傷且具有高通量的胞內(nèi)遞送方法，來實(shí)現(xiàn)大規(guī)模臨床應(yīng)用。脂質(zhì)體或聚合物誘導(dǎo)的內(nèi)吞方法對大多數(shù)細(xì)胞具有價值，但是不適合免疫細(xì)胞，因?yàn)槊庖呒?xì)胞能夠?qū)⑦@類遞送載體識別為外來敵對物并將其清除。與由質(zhì)粒DNA或mRNA間接表達(dá)的載體傳遞系統(tǒng)（即脂質(zhì)體、聚合物、慢病毒等）相比，更理想的方法是直接遞送蛋白質(zhì)，它可以消除質(zhì)粒表達(dá)的過程，減少培養(yǎng)時間，從而提高轉(zhuǎn)染效率，降低風(fēng)險。
近年來，基于瞬時膜變形破壞的胞內(nèi)傳遞技術(shù)備受重視，其幾乎可以遞送任何亞微米級靶材料，廣泛適用于各種細(xì)胞。例如電穿孔技術(shù)，能夠通過在特定電壓和頻率下一系列的電脈沖來控制細(xì)胞膜的瞬時膜變形破壞（即膜的快速打開和關(guān)閉）使靶物質(zhì)能夠瞬間遞送到細(xì)胞內(nèi)，為免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染提供了機(jī)會。但這類方法缺乏對膜穿孔變形的精確控制，過度的電場會對細(xì)胞行為產(chǎn)生不可預(yù)測的影響外，還可能導(dǎo)致細(xì)胞成分損傷（如蛋白質(zhì)變性等）。相比之下，微流控和納米技術(shù)可以精確地控制膜擾動，從而實(shí)現(xiàn)瞬時膜穿孔和隨后的胞內(nèi)遞送，在解決胞內(nèi)遞送問題中具有潛力。微流控和納米結(jié)構(gòu)可以適用于多種不同哺乳動物細(xì)胞體積和不同尺寸的細(xì)胞膜實(shí)現(xiàn)膜穿孔。細(xì)胞膜的機(jī)械擾動可通過微流體剪切、尖銳微納米結(jié)構(gòu)的擠壓和其他手段來實(shí)現(xiàn)，納米技術(shù)與激光或電的結(jié)合已經(jīng)證明了膜穿孔的可行性。這種方法可獲得很好的胞內(nèi)遞送效果，遞送效率約80%。納米針可在細(xì)胞表面相當(dāng)小的區(qū)域內(nèi)集中作用力，實(shí)現(xiàn)精確的膜穿孔和靶物質(zhì)的胞內(nèi)遞送，在解決細(xì)胞內(nèi)傳遞效率和細(xì)胞活力方面具有巨大潛力。但其應(yīng)用于懸浮細(xì)胞例如NK細(xì)胞、T細(xì)胞等時仍然存在困難，這類細(xì)胞不能自發(fā)的接觸納米針，需要在微流控和表面區(qū)域共同作用下進(jìn)行精確捕獲和控制，因此阻礙了納米針在免疫細(xì)胞的胞內(nèi)遞送和隨后的免疫治療中的應(yīng)用。目前的微納米結(jié)構(gòu)胞內(nèi)傳遞技術(shù)受到低通量或小劑量的限制，微納米結(jié)構(gòu)的小組裝面積是影響其進(jìn)一步發(fā)展到高通量的關(guān)鍵問題。因此，目前仍需開發(fā)針對懸浮免疫細(xì)胞的膜穿孔系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)高效、低損傷、高通量的胞內(nèi)遞送方法，進(jìn)而提高其真正的臨床應(yīng)用潛力。
基本信息
摘要
細(xì)胞內(nèi)傳遞和基因修飾為腫瘤免疫治療帶來了重大變革，但現(xiàn)有方法受限于遞送效率低、通量差、細(xì)胞損傷過度或不適于懸浮免疫細(xì)胞，特別是對難轉(zhuǎn)染的自然殺傷細(xì)胞。通過振動輔助納米針/微流控復(fù)合系統(tǒng)利用大面積的納米針在振動下快速穿刺和分離微通道中快速移動的懸浮細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)連續(xù)高通量的細(xì)胞內(nèi)遞送。通過大面積自組裝技術(shù)和微通道所制備的納米針陣列可以最大限度提高遞送效率。Cas9核糖核蛋白復(fù)合物（Cas9/RNPs）具有足夠的細(xì)胞膜納米穿孔尺寸可直接遞送到細(xì)胞內(nèi)，對于難轉(zhuǎn)染的免疫細(xì)胞，遞送效率高可達(dá)98%，細(xì)胞活力保持在80%左右。此外其通量顯著高于常規(guī)遞送技術(shù)，基因編輯CD96敲除的NK-92細(xì)胞通過逆轉(zhuǎn)衰竭具有更高的免疫力，實(shí)現(xiàn)高通量、高效率和低損傷性能的胞內(nèi)遞送，該策略提高了胞內(nèi)免疫療法的臨床應(yīng)用潛力。
研究內(nèi)容及結(jié)果
1.納米針/微流控復(fù)合胞內(nèi)遞送系統(tǒng)的設(shè)計與作用機(jī)理
由硅納米針陣列基底和PDMS微通道組成的細(xì)胞內(nèi)遞送芯片的示意圖（圖1a、1b）。散射區(qū)由微米柱陣列組成，可使細(xì)胞充分分散防止它們粘成團(tuán)塊（圖1c）。平行微通道的高度略高于細(xì)胞直徑，可使細(xì)胞分別穿過穿孔區(qū)域，避免細(xì)胞堆積和阻塞，提高細(xì)胞內(nèi)遞送的陽性率和通量（圖1d）。不同流道中的流場條件保持高度一致（圖1e）。在穿刺區(qū)平行通道的下方覆蓋了大面積硅納米針陣列，通過機(jī)械穿刺實(shí)現(xiàn)精確的膜穿孔（圖1f）。機(jī)械振動驅(qū)使細(xì)胞在微通道中相對運(yùn)動，使細(xì)胞能夠快速與納米針碰撞和脫離，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜的快速穿孔（圖1g）。納米針的膜穿孔大小可以充分滿足要求，可使大分子、蛋白質(zhì)等物質(zhì)從周圍介質(zhì)擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)中（圖1g）。典型“站立姿勢"細(xì)胞被刺穿并連接到納米針基底上（圖1h）。圖1i是凍干后納米針穿刺殘留細(xì)胞膜的掃描電鏡圖，可直觀地顯示膜穿孔。
圖1
2.高質(zhì)量大面積納米針表面結(jié)構(gòu)的制備
高質(zhì)量大面積納米針表面結(jié)構(gòu)的制備策略示意圖（圖2a）。反應(yīng)離子刻蝕（RIE）可以調(diào)整納米顆粒的直徑，形成非密堆積結(jié)構(gòu)，調(diào)整RIE工藝可以精確控制納米顆粒的直徑（圖2b）。電子束蒸發(fā)沉積和超聲波去除納米顆?？梢垣@得多孔金膜（圖2c）。納米柱的直徑可以通過調(diào)整化學(xué)蝕刻來精確控制（圖2d），通過RIE可以獲得大面積納米針陣列結(jié)構(gòu)（圖2e）。
圖2
3.振動輔助納米針/微流控復(fù)合胞內(nèi)遞送條件的優(yōu)化
振動頻率從40到70 Hz對細(xì)胞形態(tài)的影響最小，只有當(dāng)頻率達(dá)到70 Hz時，細(xì)胞形態(tài)才開始輕微變化（圖3）。與振動頻率相比，加速度對細(xì)胞形態(tài)的影響更為顯著，另外流速對細(xì)胞形態(tài)的影響很?。▓D3）。與對照組相比，細(xì)胞內(nèi)遞送組具有更高的熒光強(qiáng)度（圖1h，i）；細(xì)胞內(nèi)遞送組的細(xì)胞形態(tài)狀況良好，無明顯變化（圖4a）。與對照組相比，在僅振動組或僅納米針組中沒有觀察到信號；當(dāng)振動和納米結(jié)構(gòu)共存時，細(xì)胞內(nèi)遞送性能顯著提高，F(xiàn)ITC熒光陽性率超過90%；納米結(jié)構(gòu)的形態(tài)影響其胞內(nèi)遞送效率，納米針組的細(xì)胞內(nèi)遞送效率（超過90%）遠(yuǎn)高于錐形組的納米ke的細(xì)胞內(nèi)遞送效率（約40%）（圖4b，c）。在不同流速下，細(xì)胞內(nèi)遞送陽性率保持在90%以上；在低流速和過高流速下，細(xì)胞活力顯著降低；當(dāng)流速為50 μL/min和400 μL/min時，細(xì)胞活力下降；在200 μL/min的優(yōu)化流速下，細(xì)胞活力高達(dá)80%，同時保持超過90%的細(xì)胞內(nèi)遞送效率（圖4d）。使用K562、人乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-231）、原代T細(xì)胞和NK-92來評估FITC標(biāo)記的葡聚糖通過該細(xì)胞內(nèi)遞送方法的遞送效率，葡聚糖以高于90%的遞送效率成功地遞送到所有細(xì)胞中（圖4e）。
圖3
圖4
4.CRISPR-cas 9的遞送和基因編輯NK-92細(xì)胞模型的構(gòu)建
細(xì)胞內(nèi)遞送組中可觀察到GFP熒光（圖5a）。Cas9 + GFP的細(xì)胞內(nèi)遞送效率高達(dá)約98%，細(xì)胞死亡率僅為約20%（圖5b，c）。脂質(zhì)體胞內(nèi)傳遞的遞送陽性率僅為5%左右（圖5d）。電穿孔的遞送效率和細(xì)胞存活率分別約為40%和50%（圖5e，f）。與NK-92細(xì)胞相比，敲除效率約為46%（圖5h）。CD96位點(diǎn)存在明顯的基因切割（圖5i）；基因敲除后CD96蛋白的表達(dá)明顯減弱（圖5j）；敲除CD96后NK-92細(xì)胞的IFN-γ水平明顯升高（圖5k）。細(xì)胞內(nèi)遞送量超過50 mL，遞送效率可保持在90%以上（圖5l）。與對照組相比，CD96?NK-92細(xì)胞通過逆轉(zhuǎn)衰竭具有更高的免疫力（K562死亡率在0至12小時期間較高）（圖6a）。CD96?NK-92組K562細(xì)胞12 h后死亡率比對照組高10%以上（圖6b）。未來將構(gòu)建一個原型來實(shí)現(xiàn)真正臨床應(yīng)用的目的（圖6c）。
圖5
圖6
結(jié)論
近年來細(xì)胞免疫不斷發(fā)展，基因修飾NK細(xì)胞的免疫治療機(jī)制日益明確，瓶頸問題是如何有效實(shí)現(xiàn)靶材料的胞內(nèi)遞送和基因編輯。高效、標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞內(nèi)傳遞技術(shù)是其進(jìn)一步發(fā)展的關(guān)鍵。基于微納米粒子自組裝模板的制備技術(shù)是形成大面積微納米陣列結(jié)構(gòu)的重要手段之一。作者將大面積納米針與微流控技術(shù)相結(jié)合形成振動輔助納米針/微流控復(fù)合系統(tǒng)，納米針的尺寸與靶Cas9蛋白相匹配且通過機(jī)械膜穿孔成功實(shí)現(xiàn)了高通量、高效和低損傷的NK-92胞內(nèi)遞送和遺傳修飾。CD96敲除NK-92細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，抑制CD96可顯著提高NK-92細(xì)胞的免疫功能，表明該系統(tǒng)進(jìn)一步在免疫治療臨床應(yīng)用中的巨大潛力。
與目前的CAR-T免疫治療方法相比，NK細(xì)胞相關(guān)的免疫治療具有更好的安全性、多種激活細(xì)胞毒活性的機(jī)制等優(yōu)點(diǎn)。一旦安全性和制備方面的問題得到解決，其有望在癌癥治療中帶來更好的效果，NK-92細(xì)胞基因編輯結(jié)果表明該系統(tǒng)能實(shí)現(xiàn)這一功能。未來工作中將構(gòu)建原型，以達(dá)到真正臨床應(yīng)用的目的。
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