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通過振動輔助納米針/微流控復(fù)合系統(tǒng)實現(xiàn)高通量和高效胞內(nèi)遞送的方法

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文獻背景


細胞免疫療法已在腫瘤治療中取得重要的突破性成果,是最有希望消除腫瘤的治療方法之一。但該方法在實際臨床應(yīng)用中仍存在著困難與挑戰(zhàn)。最大的局限性是靶材料胞內(nèi)遞送的有效性,這是很多基因編輯免疫療法中的關(guān)鍵步驟。因此需要開發(fā)高效、低細胞損傷且具有高通量的胞內(nèi)遞送方法,來實現(xiàn)大規(guī)模臨床應(yīng)用。脂質(zhì)體或聚合物誘導(dǎo)的內(nèi)吞方法對大多數(shù)細胞具有價值,但是不適合免疫細胞,因為免疫細胞能夠?qū)⑦@類遞送載體識別為外來敵對物并將其清除。與由質(zhì)粒DNA或mRNA間接表達的載體傳遞系統(tǒng)(即脂質(zhì)體、聚合物、慢病毒等)相比,更理想的方法是直接遞送蛋白質(zhì),它可以消除質(zhì)粒表達的過程,減少培養(yǎng)時間,從而提高轉(zhuǎn)染效率,降低風(fēng)險。

近年來,基于瞬時膜變形破壞的胞內(nèi)傳遞技術(shù)備受重視,其幾乎可以遞送任何亞微米級靶材料,廣泛適用于各種細胞。例如電穿孔技術(shù),能夠通過在特定電壓和頻率下一系列的電脈沖來控制細胞膜的瞬時膜變形破壞(即膜的快速打開和關(guān)閉)使靶物質(zhì)能夠瞬間遞送到細胞內(nèi),為免疫細胞轉(zhuǎn)染提供了機會。但這類方法缺乏對膜穿孔變形的精確控制,過度的電場會對細胞行為產(chǎn)生不可預(yù)測的影響外,還可能導(dǎo)致細胞成分損傷(如蛋白質(zhì)變性等)。相比之下,微流控和納米技術(shù)可以精確地控制膜擾動,從而實現(xiàn)瞬時膜穿孔和隨后的胞內(nèi)遞送,在解決胞內(nèi)遞送問題中具有潛力。微流控和納米結(jié)構(gòu)可以適用于多種不同哺乳動物細胞體積和不同尺寸的細胞膜實現(xiàn)膜穿孔。細胞膜的機械擾動可通過微流體剪切、尖銳微納米結(jié)構(gòu)的擠壓和其他手段來實現(xiàn),納米技術(shù)與激光或電的結(jié)合已經(jīng)證明了膜穿孔的可行性。這種方法可獲得很好的胞內(nèi)遞送效果,遞送效率約80%。納米針可在細胞表面相當(dāng)小的區(qū)域內(nèi)集中作用力,實現(xiàn)精確的膜穿孔和靶物質(zhì)的胞內(nèi)遞送,在解決細胞內(nèi)傳遞效率和細胞活力方面具有巨大潛力。但其應(yīng)用于懸浮細胞例如NK細胞、T細胞等時仍然存在困難,這類細胞不能自發(fā)的接觸納米針,需要在微流控和表面區(qū)域共同作用下進行精確捕獲和控制,因此阻礙了納米針在免疫細胞的胞內(nèi)遞送和隨后的免疫治療中的應(yīng)用。目前的微納米結(jié)構(gòu)胞內(nèi)傳遞技術(shù)受到低通量或小劑量的限制,微納米結(jié)構(gòu)的小組裝面積是影響其進一步發(fā)展到高通量的關(guān)鍵問題。因此,目前仍需開發(fā)針對懸浮免疫細胞的膜穿孔系統(tǒng),實現(xiàn)高效、低損傷、高通量的胞內(nèi)遞送方法,進而提高其真正的臨床應(yīng)用潛力。



基本信息


題目:

High-Throughput and Efficient Intracellular Delivery Method via a Vibration-Assisted Nanoneedle/Microfluidic Composite System

期刊:

ACS Nano

影響因子:18.027

PMID:

36479877

通訊作者:

汪家道 馬原

作者單位:

清華大學(xué)

索萊寶合作產(chǎn)品:

產(chǎn)品貨號

產(chǎn)品名稱

K101527P

Anti-β-Actin

Polyclonal Antibody

SE134

Goat Anti-Rabbit IgG/HRP

SEKH-0046

Human IFN-γ

ELISA KIT

P9310

小鼠脾臟NK細胞

分離液試劑盒



摘要


細胞內(nèi)傳遞和基因修飾為腫瘤免疫治療帶來了重大變革,但現(xiàn)有方法受限于遞送效率低、通量差、細胞損傷過度或不適于懸浮免疫細胞,特別是對難轉(zhuǎn)染的自然殺傷細胞。通過振動輔助納米針/微流控復(fù)合系統(tǒng)利用大面積的納米針在振動下快速穿刺和分離微通道中快速移動的懸浮細胞,實現(xiàn)連續(xù)高通量的細胞內(nèi)遞送。通過大面積自組裝技術(shù)和微通道所制備的納米針陣列可以最大限度提高遞送效率。Cas9核糖核蛋白復(fù)合物(Cas9/RNPs)具有足夠的細胞膜納米穿孔尺寸可直接遞送到細胞內(nèi),對于難轉(zhuǎn)染的免疫細胞,遞送效率高可達98%,細胞活力保持在80%左右。此外其通量顯著高于常規(guī)遞送技術(shù),基因編輯CD96敲除的NK-92細胞通過逆轉(zhuǎn)衰竭具有更高的免疫力,實現(xiàn)高通量、高效率和低損傷性能的胞內(nèi)遞送,該策略提高了胞內(nèi)免疫療法的臨床應(yīng)用潛力。



研究內(nèi)容及結(jié)果



1.納米針/微流控復(fù)合胞內(nèi)遞送系統(tǒng)的設(shè)計與作用機理


由硅納米針陣列基底和PDMS微通道組成的細胞內(nèi)遞送芯片的示意圖(1a、1b)。散射區(qū)由微米柱陣列組成,可使細胞充分分散防止它們粘成團塊(圖1c)。平行微通道的高度略高于細胞直徑,可使細胞分別穿過穿孔區(qū)域,避免細胞堆積和阻塞,提高細胞內(nèi)遞送的陽性率和通量(圖1d)。不同流道中的流場條件保持高度一致(圖1e)。在穿刺區(qū)平行通道的下方覆蓋了大面積硅納米針陣列,通過機械穿刺實現(xiàn)精確的膜穿孔(圖1f)。機械振動驅(qū)使細胞在微通道中相對運動,使細胞能夠快速與納米針碰撞和脫離,從而實現(xiàn)細胞膜的快速穿孔(圖1g)。納米針的膜穿孔大小可以充分滿足要求,可使大分子、蛋白質(zhì)等物質(zhì)從周圍介質(zhì)擴散到細胞內(nèi)基質(zhì)中(圖1g)。典型“站立姿勢"細胞被刺穿并連接到納米針基底上(圖1h)。圖1i是凍干后納米針穿刺殘留細胞膜的掃描電鏡圖,可直觀地顯示膜穿孔。

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圖1


2.高質(zhì)量大面積納米針表面結(jié)構(gòu)的制備


高質(zhì)量大面積納米針表面結(jié)構(gòu)的制備策略示意圖(2a)。反應(yīng)離子刻蝕(RIE)可以調(diào)整納米顆粒的直徑,形成非密堆積結(jié)構(gòu),調(diào)整RIE工藝可以精確控制納米顆粒的直徑(圖2b)。電子束蒸發(fā)沉積和超聲波去除納米顆粒可以獲得多孔金膜(圖2c)。納米柱的直徑可以通過調(diào)整化學(xué)蝕刻來精確控制(圖2d),通過RIE可以獲得大面積納米針陣列結(jié)構(gòu)(圖2e)。

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圖2


3.振動輔助納米針/微流控復(fù)合胞內(nèi)遞送條件的優(yōu)化


振動頻率從40到70 Hz對細胞形態(tài)的影響最小,只有當(dāng)頻率達到70 Hz時,細胞形態(tài)才開始輕微變化(圖3)。與振動頻率相比,加速度對細胞形態(tài)的影響更為顯著,另外流速對細胞形態(tài)的影響很?。▓D3)。與對照組相比,細胞內(nèi)遞送組具有更高的熒光強度(圖1h,i);細胞內(nèi)遞送組的細胞形態(tài)狀況良好,無明顯變化(圖4a)。與對照組相比,在僅振動組或僅納米針組中沒有觀察到信號;當(dāng)振動和納米結(jié)構(gòu)共存時,細胞內(nèi)遞送性能顯著提高,F(xiàn)ITC熒光陽性率超過90%;納米結(jié)構(gòu)的形態(tài)影響其胞內(nèi)遞送效率,納米針組的細胞內(nèi)遞送效率(超過90%)遠高于錐形組的納米ke的細胞內(nèi)遞送效率(約40%)(圖4b,c)。在不同流速下,細胞內(nèi)遞送陽性率保持在90%以上;在低流速和過高流速下,細胞活力顯著降低;當(dāng)流速為50 μL/min和400 μL/min時,細胞活力下降;在200 μL/min的優(yōu)化流速下,細胞活力高達80%,同時保持超過90%的細胞內(nèi)遞送效率(圖4d)。使用K562、人乳腺癌細胞(MDA-MB-231)、原代T細胞和NK-92來評估FITC標記的葡聚糖通過該細胞內(nèi)遞送方法的遞送效率,葡聚糖以高于90%的遞送效率成功地遞送到所有細胞中(圖4e)。

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圖3

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圖4


4.CRISPR-cas 9的遞送和基因編輯NK-92細胞模型的構(gòu)建


細胞內(nèi)遞送組中可觀察到GFP熒光(圖5a)。Cas9 + GFP的細胞內(nèi)遞送效率高達約98%,細胞死亡率僅為約20%(圖5b,c)。脂質(zhì)體胞內(nèi)傳遞的遞送陽性率僅為5%左右(圖5d)。電穿孔的遞送效率和細胞存活率分別約為40%和50%(圖5e,f)。與NK-92細胞相比,敲除效率約為46%(圖5h)。CD96位點存在明顯的基因切割(圖5i);基因敲除后CD96蛋白的表達明顯減弱(圖5j);敲除CD96后NK-92細胞的IFN-γ水平明顯升高(圖5k)。細胞內(nèi)遞送量超過50 mL,遞送效率可保持在90%以上(圖5l)。與對照組相比,CD96?NK-92細胞通過逆轉(zhuǎn)衰竭具有更高的免疫力(K562死亡率在0至12小時期間較高)(圖6a)。CD96?NK-92組K562細胞12 h后死亡率比對照組高10%以上(圖6b)。未來將構(gòu)建一個原型來實現(xiàn)真正臨床應(yīng)用的目的(圖6c)。

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圖5

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圖6



結(jié)論


近年來細胞免疫不斷發(fā)展,基因修飾NK細胞的免疫治療機制日益明確,瓶頸問題是如何有效實現(xiàn)靶材料的胞內(nèi)遞送和基因編輯。高效、標準的細胞內(nèi)傳遞技術(shù)是其進一步發(fā)展的關(guān)鍵?;谖⒓{米粒子自組裝模板的制備技術(shù)是形成大面積微納米陣列結(jié)構(gòu)的重要手段之一。作者將大面積納米針與微流控技術(shù)相結(jié)合形成振動輔助納米針/微流控復(fù)合系統(tǒng),納米針的尺寸與靶Cas9蛋白相匹配且通過機械膜穿孔成功實現(xiàn)了高通量、高效和低損傷的NK-92胞內(nèi)遞送和遺傳修飾。CD96敲除NK-92細胞中發(fā)現(xiàn),抑制CD96可顯著提高NK-92細胞的免疫功能,表明該系統(tǒng)進一步在免疫治療臨床應(yīng)用中的巨大潛力。

與目前的CAR-T免疫治療方法相比,NK細胞相關(guān)的免疫治療具有更好的安全性、多種激活細胞毒活性的機制等優(yōu)點。一旦安全性和制備方面的問題得到解決,其有望在癌癥治療中帶來更好的效果,NK-92細胞基因編輯結(jié)果表明該系統(tǒng)能實現(xiàn)這一功能。未來工作中將構(gòu)建原型,以達到真正臨床應(yīng)用的目的。


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