手把手教你|小分子ELISA試劑盒的標(biāo)曲制作

更新時(shí)間：2021-07-23

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小分子抗原或半抗原因缺乏可用于夾心法的兩個(gè)或兩個(gè)以上的不同位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法模式。檢測(cè)原理是待測(cè)樣本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。樣本中抗原含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等的ELISA測(cè)定多用競(jìng)爭(zhēng)法。

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實(shí)例講述

背景簡(jiǎn)介

嘔吐毒素（DON）是其中最重要一種毒素，主要來自鐮刀菌屬，尤其是禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌。由于它可以引起豬的嘔吐，故又名嘔吐毒素（vomitoxin，VT）。DON廣泛存在于全球，主要污染小麥、大麥、玉米等谷類作物，也污染糧食制品，人畜攝入被DON污染的食物、飼料后，會(huì)導(dǎo)致厭食、嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、站立不穩(wěn)、反應(yīng)遲鈍等急性中毒癥狀，嚴(yán)重時(shí)損害造血系統(tǒng)造成死亡。HPLC等檢測(cè)方法前處理步驟繁瑣且費(fèi)用昂貴，ELISA方法具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，樣品前處理相對(duì)簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，可經(jīng)濟(jì)、快速地檢測(cè)大量樣品。

檢測(cè)原理

索萊寶自主研發(fā)的嘔吐毒素（DON）ELISA試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。首先將嘔吐毒素抗原結(jié)合到酶標(biāo)板微孔條上，實(shí)驗(yàn)時(shí)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品的嘔吐毒素與包被的嘔吐毒素抗原競(jìng)爭(zhēng)生物素標(biāo)記的抗嘔吐毒素單抗上的結(jié)合位點(diǎn)，游離的成分被洗去。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，生物素與親和素特異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB)，TMB在辣根過氧化物酶的催化下呈現(xiàn)藍(lán)色，加終止液后變成黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值，嘔吐毒素濃度與OD450值之間呈反比，樣本吸光值與其含有的嘔吐毒素成負(fù)相關(guān)。

數(shù)據(jù)分析

競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第一種定性分析方法，而定量判定用第二種方法。競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的標(biāo)曲制作和濃度計(jì)算與雙抗體夾心法ELISA試劑盒明顯不同，具體詳細(xì)說明如下：

定性分析

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.527，樣本2的吸光度值為1.225，標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值分別是：0ppb為2.044；5 ppb為1.758；15 ppb為1.368；45 ppb為0.783；135 ppb為0.287；405 ppb為0.092。則樣本1的濃度范圍是45ppb～135 ppb；樣本2的濃度范圍是15 ppb～45 ppb，再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中嘔吐毒素的濃度范圍。

定量分析

1、百分吸光率的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即

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B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0(ppb)標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

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2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以嘔吐毒素（ppb）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，【注意：標(biāo)準(zhǔn)曲線OD值范圍需處于0-3之間；標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)出直線或類似直線形式，以增加標(biāo)準(zhǔn)曲線函數(shù)計(jì)算的擬合度，有利于提高樣本濃度測(cè)量準(zhǔn)確性】。本試劑盒中以嘔吐毒素（ppb）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，是依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液濃度分別是：0ppb；5 ppb；15 ppb；45 ppb；135 ppb；405 ppb，5 ppb-405 ppb濃度間呈現(xiàn)出后一濃度為前一濃度的3倍，進(jìn)行對(duì)數(shù)計(jì)算，數(shù)據(jù)如下：

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依據(jù)最后計(jì)算出的橫縱坐標(biāo)數(shù)值，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線圖的繪制

方法一：利用Excel中曲線擬合方法進(jìn)行分析

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方法二：利用試劑盒專業(yè)分析軟件（ELISA Calc軟件）進(jìn)行分析計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確計(jì)算和快速分析。

A.進(jìn)行數(shù)據(jù)輸入

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B.選擇“Logstics四參數(shù)擬合"模型

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C.點(diǎn)擊“回歸/擬合（R）"，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

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D.運(yùn)算后可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線

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E.點(diǎn)擊“回歸方程"得到擬合曲線方程式，點(diǎn)擊“復(fù)制"即可將標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程復(fù)制出來。

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四參數(shù)Logistic曲線擬合

方程: y = (A - D) / [1 + (x/C)^B] + D

A= 89.02779 B= 4.07558 C= 3.34729

D=-7.61541 r^2=0.99935

F.點(diǎn)擊“由Y計(jì)算X"，得到橫軸數(shù)值

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說明：

樣本1的吸光度值為0.527，樣本2的吸光度值為1.225；則其百分吸光度值（%）分別是樣本1為25.8；樣本2為59.9，點(diǎn)擊“由Y計(jì)算X"得到橫軸數(shù)值分別是樣本1為3.91；樣本2為2.72，則其濃度需要進(jìn)行對(duì)數(shù)換算，可得樣本1濃度為59.78ppb，樣本2濃度為20.12ppb。

索萊寶競(jìng)爭(zhēng)法ELISA試劑盒產(chǎn)品（部分）

產(chǎn)品貨號(hào)	英文名稱	中文名稱
SEKSM-0002	Progesterone ELISA KIT	孕酮檢測(cè)試劑盒
SEKSM-0003	Testosterone ELISA KIT	睪酮檢測(cè)試劑盒
SEKSM-0004	AFB1 ELISA KIT	黃曲霉毒素 B1 檢測(cè)試劑盒
SEKSM-0005	AFM1 ELISA KIT	黃曲霉毒素 M1 檢測(cè)試劑盒
SEKSM-0006	MEL ELISA KIT	三聚氰胺酶檢測(cè)試劑盒
SEKSM-0007	DON ELISA KIT	嘔吐毒素檢測(cè)試劑盒
SEKSM-0008	17β-Estradiolum ELISA KIT	雌二醇檢測(cè)試劑盒
SEKSM-0009	Zearalenone ELISA KIT	玉米赤霉烯酮檢測(cè)試劑盒
SEKSM-0024	Lipopolysaccharides (LPS) ELISA KIT	脂多糖/ 內(nèi)毒素（LPS) 檢測(cè)試劑盒

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