WB實(shí)驗(yàn)流程
樣本制備的步驟
關(guān)于樣本采集和保存，蛋白提取的相關(guān)
知識和技巧請查看：
接下來，讓小編帶您總結(jié)關(guān)于蛋白定量和蛋白變性相關(guān)的知識點(diǎn)：
一
蛋白定量
測定蛋白常用的方法有Bicinchoninic acid (BCA)法、Lowry法和Bradford法（考染法）
1. BCA法的測定原理是蛋白質(zhì)將銅離子還原成亞銅離子，后者在堿性溶液中與BCA結(jié)合生成紫紅色結(jié)合物，該復(fù)合物在562nm處有吸光值且與蛋白質(zhì)濃度成正相關(guān)性，據(jù)此可測定蛋白質(zhì)濃度?？捡R斯亮藍(lán)在游離狀態(tài)下呈紅色，大光吸收在488nm；當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì)—色素結(jié)合物在595nm波長下有大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定。
2. Lowry法又稱為Folin-酚試劑法，首先在堿性溶液中形成銅-蛋白復(fù)合物，然后這一復(fù)合物還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑（Folin-酚上級），產(chǎn)生鉬藍(lán)和鎢藍(lán)復(fù)合物的深藍(lán)色，這種深藍(lán)色的復(fù)合物在745~750nm處有大的吸收峰，顏色的深淺（吸收值）與蛋白質(zhì)濃度成正比，可根據(jù)750nm的光吸收值大小計算蛋白質(zhì)的含量。
3. Bradford法又稱為考染法。染料結(jié)合法測定蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度較高，可檢測到微量蛋白，操作簡便，試劑配制極簡單，重復(fù)性好，但干擾因素多。考馬氏亮藍(lán)G-250具有紅色和青色兩種色調(diào)、在酸性溶液中游離狀度下為棕紅色，當(dāng)它通過疏水作用與蛋白質(zhì)結(jié)合后，變成藍(lán)色，大吸收波長從465nm轉(zhuǎn)移到595nm處，在一定的范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)含量與595nm的吸光度成正比，測定595nm處光密度值的增加即可進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量。
三者之中，Lowry法與BCA同屬化學(xué)法，Lowry法是藥典中使用的蛋白濃度測定方法，但是操作繁瑣，實(shí)驗(yàn)時間長。BCA法操作簡單，時間短，形成的顏色復(fù)合物穩(wěn)定性強(qiáng)，但可能受一些雜質(zhì)影響。Bradford屬于染料結(jié)合法，也易受到去垢劑影響。
二
蛋白變性
蛋白變性常用方式是高溫煮樣，煮樣條件設(shè)置為100℃，根據(jù)樣品量的多少，設(shè)置時間5~15min，煮樣時間過長，一些蛋白可能會產(chǎn)生聚集性沉淀。疏水性*的蛋白質(zhì)，如含有多個跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，在煮沸時可能會發(fā)生聚集或寡聚化，因此，其煮樣條件為40℃~55℃條件下，溫浴10~60min變性。煮樣后的樣本于-20℃或-80℃保存。
提取并定量后，并未加Loading Buffer煮樣的蛋白樣品，保存于-80℃時，防止反復(fù)凍融，并盡量于1周內(nèi)加Loading Buffer煮樣處理，不要超過2周。
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產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號 |
Bradford法蛋白濃度測定試劑盒 | PC0010 |
BCA蛋白濃度測定試劑盒 | PC0020 |
Lowry法蛋白濃度測定試劑盒 | PC0030 |
4×蛋白上樣緩沖液 （含DTT） | P1015 |
4×蛋白上樣緩沖液 （含巰基還原劑） | P1016 |
4×非變性蛋白上樣緩沖液 | P1017 |
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