Annexin V PE/7-AAD 凋亡檢測試劑盒

品牌：Solarbio | 貨號：CA1030|規(guī)格:25T/50T/100T|保存：2-8度避光保存，勿冰凍。

產(chǎn)品簡介：
細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面，這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸（PS）從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使 PS 暴露在細(xì)胞膜外表面。PS 是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS 暴露在細(xì)胞膜外。Annexin V 具有易于結(jié)合到磷脂類如 PS 的特性，對 PS 有高度的親和性。因此，該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測暴露在細(xì)胞膜表面的 PS。PS 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所*的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的，而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就破壞了。因此，可以采用 AnnexinV 與7-AAD 雙染的方法，通過流式檢測細(xì)胞早期凋亡。

操作步驟:

1、細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備： a)對于貼壁細(xì)胞：小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液到一離心管內(nèi)備用。用不含 EDTA 的胰酶消化細(xì)胞，細(xì)胞可以被輕輕 用移液管或槍頭吹打下來時，加入前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細(xì)胞，并輕輕吹散細(xì)胞。再次 收集到離心管內(nèi)。1000rpm 左右離心 5min，沉淀細(xì)胞。對于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞無法*離心離心管底， 可以適當(dāng)延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約 50µl 左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。加入約 1ml 4℃預(yù)冷的 PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清； b)對于懸浮細(xì)胞：1000rpm 左右離心 5min，沉淀細(xì)胞。對于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞無法*離心離心 管底，可以適當(dāng)延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約 50µl 左右的培養(yǎng)液，以避免 吸走細(xì)胞。加入約 1ml 4℃ 預(yù)冷的 PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清；

2、用去離子水按 1:3 稀釋結(jié)合緩沖液(4ml 4x 結(jié)合緩沖液+12ml 去離子水)；

3、用 1x 結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為 1-5×106 /ml；

4、取 100µl 的細(xì)胞懸液于 5ml 流式管中，加入 5µlAnnexin V/PE 混勻后于室溫避光孵育 5 分鐘；

5、加入 10µl 20ug/ml 的 7AAD，并加 400µl PBS，立刻進行流式檢測。

實驗設(shè)計：

1）未轉(zhuǎn)染細(xì)胞 空白管：陰性對照組細(xì)胞，不加 Annexin V/PE，7AAD。用于調(diào)節(jié)電壓； 單染管：陽性對照組細(xì)胞，只加 Annexin V/PE 或只加 7AAD。用于調(diào)節(jié)補償； 檢測管：處理的細(xì)胞，加 Annexin V/PE，7AAD。用空白管和單染管調(diào)節(jié)好電壓補償后，獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。

2）轉(zhuǎn)染 GFP 未轉(zhuǎn)染空白管：未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，不加 Annexin V/PE，7AAD。用于調(diào)節(jié)電壓； 未轉(zhuǎn)染單染管：未轉(zhuǎn)染且有明顯凋亡的細(xì)胞，只加 Annexin V/PE 或只加 7AAD。用于調(diào)節(jié)補償； 轉(zhuǎn)染 GFP 空白管：轉(zhuǎn)染 GFP 對照組細(xì)胞，不加 Annexin V/PE，7AAD。用于調(diào)節(jié)補償 檢測管：處理的細(xì)胞，加 Annexin V/PE，7AAD。調(diào)節(jié)好電壓補償后，獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。

注意事項：

1、Annexin V 是與磷脂酰絲氨酸(PS)親和，而 PS 在不同種屬間沒差異。在正常細(xì)胞中，PS 只分布在細(xì)胞膜脂 質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，PS 由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)；

2、低濃度胰酶消化，輕柔吹打貼壁細(xì)胞 2～3 次，離心機 4℃1000rpm 5min 離心，處理得當(dāng)?shù)脑?，胰酶造成損 傷可以控制在 5%以內(nèi)，有對照組的情況下對實驗結(jié)果不會造成明顯影響。

3、先加PI 不僅染色是否每組都均勻充分很難判斷，而且 PI 本身對細(xì)胞也是有毒性的，對實驗結(jié)果影響會比胰 酶大，不建議這樣做；

4、Annexin V 是Ca 依賴的蛋白，所以不能加入 EDTA，防止 EDTA 螯合了 Ca 離子從而影響 Annexin V，進而影 響結(jié)果。

5、用流式檢測凋亡時，PI 受時間的影響很大，因標(biāo)記了 PI 后會加大細(xì)胞毒性，隨著時間延長會導(dǎo)致 PI 的染 色增加，特別是檢測早期凋亡時，如果時間延長除了會導(dǎo)致在流式細(xì)胞儀上的細(xì)胞分群差距加大外，誤差會明顯 加大。一般 PI 加上后立刻上機，然后在一個小時內(nèi)檢測完成。兩種方法都可以，但是按照我們操作步驟造成 的誤差會更小。

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