一、裝載探針：
對于刺激時間較短（通常為2 小時以內(nèi)）的細(xì)胞，先裝載探針，后用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞。對于細(xì)胞刺激時間較長（通常為6 小時以上）的細(xì)胞，先用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞，后裝載探針。
原位裝載探針：本方法僅適用于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞。按照1 ∶1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10μ mol/L。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA。加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜，通常對于六孔板的一個孔加入稀釋好的DCFH-DA不少于1mL 。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 分鐘。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。通常活性氧陽性對照在刺激細(xì)胞20～30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
收集細(xì)胞后裝載探針：按照1 ∶1000 用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10μmol/L。細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細(xì)胞濃度為一百萬二千萬/mL ，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。每隔3 ～5 分鐘顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。直接用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞，或把細(xì)胞等分成若干份后刺激細(xì)胞。通?；钚匝蹶栃詫φ赵诖碳ぜ?xì)胞20～30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
說明：僅在陽性對照孔中加入Rosup作為陽性對照，其余孔不必加入Rosup。
二、檢測：
對于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測。對于收集細(xì)胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測，也可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。
三、參數(shù)設(shè)置
使用488nm 激發(fā)波長，525nm 發(fā)射波長，實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強弱。DCF 的熒光光譜和FITC非常相似，可以用FITC的參數(shù)設(shè)置檢測DCF 。
